A sejtmag (nucleus, vagy karyon)

A sejtmagot Boveri fedezte fel 1831-ben, tehát még a sejttan hőskorában. Ez elsősorban annak volt köszönhető, hogy a sejtmag az élő sejtekben jóval erősebben fénytörő, mint a környező citoplazma és így festés nélkül is viszonylag jól látható. Másrészt nagyon intenzíven köti a bázikus kémhatású festékeket (basofil festődésű), ezért a rögzített (fixált) preparátumokon is könnyű láthatóvá tenni.

A sejtmag alakja legtöbbször gömb vagy tojásdad alakú. Mérete, formája nagyrészt követi a sejt méretét és alakját. A sejtmag mérete általában a teljes sejt térfogatának 10%-a lehet. A gömb vagy kocka formájú sejtekben a sejtmag is gömbölyded, a henger vagy orsó alakú sejtekben inkább elnyúlt tojásdad sejtmagokat láthatunk. Számos sejttípus rendelkezik karélyozott, elágazó vagy fogaskerékszerű sejtmaggal.

A nucleus festődése legtöbbször márványozott mintázatot mutat. Már a korai vizsgálatok alapján is kiderült, hogy a sejtmag anyaga (a kromatin) kétféle állapotban van. Van egy világosan festődő, lazább szerkezetű része, az eukromatin, és egy sötétebben festődő, sűrűbb, tömöttebb része, a heterokromatin. E festődésnek a hátterében a modern vizsgálatok eredményei szerint jelentős funkcionális különbség áll, ahogy azt látni fogjuk.

A sejtmagot a maghártya választja el a környező citoplazmától. A maghártyát két egymásba hajló membrán alkotja. Rajta pórusok vannak és a pórusok területén hajlik át a két lemez egymásba. A maghártya külső rétege folyamatosan megy át az endoplazmatikus hálózatba. Ennek megfelelően a maghártya külső lemezén megfigyelhetők a riboszómák, ugyanúgy, mint az endoplazmatikus hálózat membránfelszínén. A maghártya belső feszínéhez a lamin nevű fibrilláris fehérjékből felépülő, viszonylag rigid lemez (nuclear lamina) tapad, ami megtartja a nucleus formáját. A külső réteghez a citoplazma felől elsősorban intermedier filamentumok (l. később) által alkotott, laza, kosárszerű sejtvázhálózat rögzül. Ez a sejtmag állandó helyzetét biztosítja a citoplazmán belül.

2. ábra A sejtmag és a maghártya felépítése, a lamina nuclearis és a sejtmaghoz kapcsolódó sejtvázelemek

A sejt DNS-tartalmának döntő többsége a sejtmagban lokalizálódik. Mai elképzeléseink szerint a sejtmag kialakulásának a törzsfejlődés során legalább két oka lehetett. Egyrészt a nagyon hosszú DNS molekulákat el kellett választani a citoplazmától és megfelelő struktúrában kellett elrendezni ahhoz, hogy egyáltalán elférjenek a sejtben. Másrészt az eukarióta mRNS szintéziséhez és éréséhez szükséges enzimrendszereket is a DNS közelében és a citoplazmatikus enzimektől elválasztva kellett tartani ahhoz, hogy megfelelő hatásfokkal tudjanak dolgozni.

Az eukarióták sejtmagjában a prokariótákhoz képest óriási mennyiségű DNS található. Emberben pl. az összes DNS durván 6x109 nucleotidból áll. Ez a DNS-mennyiség 46 kromoszómába van becsomagolva. Egy kromoszómában kb. 50-250x106 bázispár hosszúságú DNS-molekula van. Ezek a molekulák (ha a DNS-szálak teljesen ki lennének egyenesedve) 1,2-8,5 cm hosszúak volnának.

A DNS mennyisége nem függ össze a törzsfejlődési-fejlettségi fokkal. Emberben pl. 700x annyi DNS van, mint az E. coliban, de egy kétéltűben 30-100x több DNS lehet, mint egy emberben.

3. ábra A törzsfejlődés különböző fokain álló élőlények sejtjeiben mérhető DNS-tartalom összehasonlítása

Az ember sejtmagvaiban levő DNS elegendő lenne akár 3 millió átlagos nagyságú fehérje kódolásához, de a mai felfogásunk szerint legfeljebb 30.000 funkcionális génünk van. (A Drosophilában 2.500-3.000 gént lehet azonosítani, ami azt jelenti, hogy kb. 10x vagyunk bonyolultabbak, mint a legyecske.) Az általános felfogás szerint minden DNS-szakasz, amely egy funkcionális mRNS-t hoz létre, egy génnek tekinthető. Egy-egy gén hossza kb. 100.000 bázispár lehet. Ugyanakkor egy átlag mRNS csupán 1.000 bázisból áll. Ma már tudjuk, hogy a DNS-en a rövid kódoló régiókat (exon) hosszú, nem kódoló szakaszok (intron) választják el egymástól. A géneknek ezen felül vannak szintén nem kódoló, de a funkció szempontjából meghatározó, ún. szabályozó régióik is. E funkcionális DNS-szakaszokat nagyon hosszú, egyelőre értelmezhetetlen DNS-részek választják el egymástól. A számítások szerint a kódoló és a nem kódoló DNS-részek aránya 1:9 lehet szinte valamennyi eddig ilyen szempontból tanulmányozott élőlényben.

Ez az arány nem csak becsléseken alapszik. Megállapították az ember és az egér genomiális szekvenciájának összehasonlításával, hogy a nagyrészt azonos DNS-szakaszok legfeljebb a teljes DNS 10%-át teszik ki. Ennek az a magyarázata, hogy az élet szempontjából fontos információkat hordozó, kódoló DNS-szakaszok konzerválódtak a törzsfejlődés során, míg a nem kódolókban - azalatt az idő alatt, amióta a törzsfejlődés során elváltunk az egértől - szabadon történhettek mutációk. Az egértől 80x106 éve váltunk el. Ezalatt az idő alatt a nem kódoló DNS-régiókban minden tripletből két bázist érinthetett mutáció. Azaz, az egérben és az emberben nagyrészt azonos szekvenciájú DNS-részek lehetnek a funkcionálisak, a különböző bázissorrendűek pedig a nem kódoló DNS-szakaszok. Ezek aránya 1:9, ahogy azt a korábbi megfontolások is sugallták. Felmerül a kérdés, hogy a DNS-tartalom 90%-a miért másolódik minden szervezet minden sejtjében az osztódások során, ha semmiféle jelentősége nincs a szervezet működésében? Erre, sajnos, ma nincs még kielégítő válasz, de még elképzelés sem nagyon.

A sejtmagban a DNS sosem önmagában, hanem számos fehérjével asszociáltan található meg, legnagyobb része azokra vagy azokba van csomagolva. A magfehérjéket két nagy csoportra oszthatjuk: a hisztonokra (histon) és a nem hisztonokra (non-histon). Hiszton fehérjék csak az eukarióta szervezetekben fordulnak elő. A hiszton fehérjék mennyisége a sejtmagban gyakorlatilag megegyezik a DNS mennyiségével. A hisztonok kis méretű fehérjék, 102-135 aminosavból épülnek fel. Lizinben és argininben nagyon gazdagok, ennek következtében az egész molekula pozitív töltésű. Ennek az a következménye, hogy a negatív töltésű DNS-hez erősen kapcsolódnak, függetlenül annak bázissorrendjétől. Ötféle hiszton molekulát ismerünk. A H2A, H2B, H3 és H4 hisztonok az ún. nucleosomális hisztonok (l. később). Aminosavsorrendjük, szerkezetük szinte minden eukariotában ugyanaz, azaz a törzsfejlődés során igen erősen konzerválódott. Ez egyben azt is jelenti, hogy a funkciójukban szinte minden aminosav fontos szerepet tölt be. A H1 nem vesz részt a nucleosoma felépítésében, funkciója és szerkezete is eltér kissé a többi hisztonétól és nem annyira konzervatív a szerkezete (l. később). A hisztonok jelenléte és hibátlan működése létfontosságú. Ha bármelyik hisztonban mutáció okozta elváltozás van, a sejt elpusztul, vagy legalábbis olyan mennyiségben termel mRNS-eket, hogy nem tudja kezelni őket és a legtöbb működése leáll.

A nucleosomákat Virginia Foe fedezte fel az 1970-es években. Először dekondenzálta a DNS-molekulákat, aminek következtében az elektronmikroszkópos képen is jól megfigyelhető, gyöngysorra emlékeztető szerkezetet vett fel a DNS és a hozzá asszociált fehérjék együttese. Enyhe DN-áz emésztés hatására a gyöngysor szétesett „gyöngyökre” és az őket összetartó „lánc” eltűnt. Ha ekkor az oldatban levő gyöngyöket magas sókoncentrációjú oldatba helyezte, akkor azok újabb alkotóelemekre estek szét. A fehérjefrakcióban a négy nucleosomalis hiszton, míg a DNS-frakcióban 146 nucleotid hosszúságú fragmentek voltak kimutathatók.

4. ábra A nucleosoma és a rátekeredett DNS térbeli modellje (A), valamint a nucleosomák alapvető szerkezetét tisztázó kísérlet vázlata (B)

Ezen megfigyelések és még néhány más eredmény alapján alkották meg a modellt, miszerint a négy nucleosomális hiszton egy korong alakú struktúrába tömörül és két korong lapjával összetapad. Erre a szerkezetre a DNS rácsavarodik és mintegy másfél fordulatot tesz a nucleosoma körül. A másfél fordulatnyi DNS-t 146 bázispár (bp) alkotja.

A nucleosomák között 80 bp hosszúságú, ún. linker (összekötő) régiók vannak. Ezek a linker régiók sokkal érzékenyebbek a DN-áz emésztésre, mint a nucleosomákra csavarodott DNS-szakaszok. A nucleosomális szerkezet az első szintje azon mechanikai probléma feloldásának, hogy miként lehet az óriási DNS molekulákat egy áltagosan 5 µm átmérőjű sejtmagba begyömöszölni. A DNS a hiszton oktamerekhez nem szekvenciaspecifikusan köt. Úgy tartják, hogy a hisztonok felé a DNS A-T-ben gazdagabb részei, kifelé pedig a C-G-ben gazdagabb részei helyezkednek el. Emellett vannak olyan, hosszabb-rövidebb DNS-szakaszok, amelyek soha nem kötődnek nucleosomákhoz. E régiókban a gének szabályozó régiói helyezkednek el és nukleáz emésztésre érzékenyek. Például az SV40 vírus DNS-én a hisztonokra tekeredő részek előtt van egy 300 bp hosszúságú szakasz, amely nem asszociálódik hisztonokkal, csak más típusú, elsősorban regulátor funkcióval rendelkező fehérjékkel. Ezek viszont nem védik meg a virális DNS-t a DN-áz emésztéstől. Ugyancsak szabályozó fehérjék kötnek a DNS linker régióihoz, amelyek kapcsolódása már szekvencia-specifikus.

A DNS csomagolásának, tömörítésének, ún. kondenzálódásának következő szintjében a H1 hisztonnak van alapvető szerepe. A H1 molekulák a nucleosomákat pénztekercshez hasonlítható oszlopokba, rudakba fogják össze. Ezen rudak hatosával rendeződve 30 nm átmérőjű szálakba tömörülnek.

5. ábra A H1 hiszton funkciója a nucleosomák összetartása egy oszlop alakú szerkezetbe

Ha csak ez a szerkezet biztosítaná a DNS kondenzálódását, akkor a számítások szerint a DNS kb. 0,1 mm hosszúságú lenne. Tehát még további szerkezeti változásokat kell feltételeznünk, de ennek természetéről kísérleti adatok még nem álnak rendelkezésre.

Összességében azt mondhatjuk, hogy a nucleosomális szerkezetben levő kondenzált DNS képezi a kromatin erősebben festődő, nagyobb anyagtartalmú heterokromatin részét, míg a nem, vagy kevésbé kondenzált részek alkotják a lényegesen kisebb mennyiségű eukromatint.

6. ábra A heterokromatin szerkezetének, kondenzációjának egyre magasabb szintjei a nucleosomális rendezettségtől a kromoszómáig

Egyes kivételes esetekben a DNS replikációját nem követi a sejt osztódása. Ha ilyenkor az utódkromoszómák együtt maradnak, ún. óriáskromoszómák jönnek létre. Ilyenek a Drosophila lárvális nyálmirigyében fénymikroszkópban is kitűnően megfigyelhető óriáskromoszómák, amelyekben 1000x több DNS található, mint más sejttípusok kromoszómáiban. Az óriáskromoszóma erősen és jellegzetesen struktúrált szerkezet. Rajta sötétebben és világosabban festődő csíkolat figyelhető meg. A sötét csíkok tartalmazzák a kondenzált állapotban levő heterokromatint. Ezeket „band”-nek nevezzük. Az eukromatin a világosabb, lazább szerkezetű csíkokból épül fel. Ezek az „interband” régiók, vagy más néven „puffok”, mert a kromoszóma itt jellegzetesen megvastagszik, kidudorodik.

7. ábra A Drosophila lárvális nyálmirigyében megfigyelhető óriáskromoszóma rajza (A), Egy kromoszóma részlete a „band”-ekkel és „interband”-ekkel (B) és egy puff területén a triciált uridin RNS-be való beépülését mutató ezüstszemcsék az autoradiogramon (C).

A band-ek a kromoszóma 85%-át, az interband-ek a 15%-át teszik ki. A puffok száma 3-4000 közé tehető, amely szám nagyon jól korrelál a prediktált gének számával. Ashburner és Friström munkái alapján tudjuk, hogy RNS csak vagy elsősorban a puffok területén másolódik a DNS-ről. Ezt úgy igazolták, hogy a triciált uridin csak az interband-ekben ad jelet az autoradiogramokon, a band-ek fölött nem. Azaz új RNS-molekulák csak a puffok területén szintetizálódnak. Következésképp, az állat fejlődési és fiziológiai állapotának megfelelően aktiválódott gének a puffokban helyezkednek el. A DNS a puffok területén aktív, míg az interband-ekben gyakorlatilag inaktív.

A puffok megoszlása az óriáskromoszómákon jellegzetes mintázatot ad az egyedfejlődés különböző szakaszaiban. E mintázatot a fejlődést szabályozó hormonok (ecdyson, juvenil hormon) határozzák meg, amit kísérletesen nagyon jól lehet igazolni. A hormonkezelések egyes puffokat megszüntetnek, mások megjelenését serkentik – más szavakkal: a hormonkezelés hatására egyes gének ki-, mások bekapcsolnak.

Kezdetben úgy tartották, hogy egy-egy puff egy-egy génnek felel meg. Ma már tudjuk, hogy egyes puffokban több gén is elhelyezkedhet. Ezek kifejeződését általában azonos szabályozó régiók kontrollálják. Ritka kivételként az is előfordulhat, hogy egy-két gén a band-ekben is aktiválódik és mRNS másolódik róla. Emlősökben is hasonló a helyzet. Igaz, gerincesekben nincsenek óriáskromoszómák, de az megállapítható, hogy enyhe DN-áz emésztés hatására a teljes DNS-tartalomnak csupán 10%-a esik szét, a többi (a nucleosomákhoz kötött, heterokromatinizált rész) intakt marad. Az eukromatin-heterokromatin (az aktív és inaktív DNS) aránya tehát 1:9 szinte minden ilyen szempontból tanulmányozott élőlény esetében.

A sejtmagnak két alapvető funkciója van. Az egyik a DNS-replikáció a sejtosztódás S fázisában. Erről és a sejtosztódás folyamatáról, molekuláris mechanizmusáról, szabályozásáról egy következő fejezetben irunk. A sejtmag másik fő funkciója az mRNS-szintézis, azaz a aktuálisan aktív génekről való mRNS-másolás, amit transcriptionak nevezünk. A továbbiakban azt követjük nyomon, hogy az érett mRNS miként keletkezik, hogyan módosul(hat), kerül ki a sejtmagból és látja el funkcióját a citoplazmában (ezt a folyamatot összefoglalóan RNS-processing-ként említi a szakirodalom).

Az RNS-szintézis nagyon aktív és nagyon szelektív folyamat. Interfázisban (az osztódások közötti időszakban) kb. 20x annyi bp épül be RNS-ekbe, mint a replikáció során keletkező kromoszómális DNS-ekbe. A transcriptio szelektivitása nagyon erős. Emlősökben a totál DNS-nek legfeljebb 1%-a íródik át működő RNS-re. Ezt a szelektivitást részben az okozza, hogy a DNS-nek csak egy része (10%-a) íródik át, másrészt az átírt RNS molekuláknak csak kis százaléka éli túl a processing-et és kerül abba az állapotba, hogy működőképesen kerülhessen ki a citoplazmába.

Az egész folyamat legalább hat ponton szabályozható és szabályozott. A szintézis és a processing ezen lépéseit mutatja a 8. ábra.

8. ábra A mRNS-szintézis és processing lépései és szabályozási pontjai