Az RNS-polimerázok és a transzkripció

Az RNS-polimerázok a transzkripció, vagyis a génkifejeződés (expresszió) kulcsenzimei. Prokariótákban az RNS-polimeráz hatalmas fehérjekomplex, kb. 500 kD méretű és két α, egy β, egy β1 és egy δ alegységből áll. A transzkripció akkor indul el, amikor az RNS-polimeráz komplex a gén promoter régiójához (a TATA boxhoz) kötődik. Ekkor szétnyílik a DNS két szála (ún. open komplex jön létre). Ezután a polimeráz megindul a DNS-templát egyik szálán és elkezdi készíteni a komplementer RNS molekulát 5’-3’ irányban. Miután kb. 8 bp feltöltődött, a polimeráz δ alegysége leválik a komplexről és így lehetővé válik az elongatios faktorok kapcsolódása a polimeráz komplexhez. Az elongatios fehérjék a keletkező RNS nyújtva tartásához és a terminációhoz szükségesek. Nélkülük sok, de rövid, értelmetlen mRNS íródik át a DNS-ről. Amikor a polimeráz eléri a stop szignált a genomiális DNS-en, a megszintetizált RNS-sel együtt lelép a DNS-ről.

9. ábra A mikrobiális transzkripció lépései vázlatrajzon

Eukarióta szervezetekben háromféle RNS-polimeráz enzim fordul elő. Az RNS-polimerázok közötti különbségeket az α-amanitinnel szemben mutatott érzékenységük alapján határozták meg.

Az α-amanitin teljesen meggátolja az RNS-polimeráz II működését, amely az mRNS-ek átírását végzi. Az α-amanitinre egyáltalán nem érzékeny az RNS-polimeráz I, ami a riboszómális RNS-ek (rRNS) átírásához szükséges.

Közepesen érzékeny az α-amanitinre az RNS-polimeráz III, amely a tRNS-ek és más kisméretű stabil RNS molekulák átírásáért felelős.

Az eukariótákban az RNS-polimeráz II kapcsolódása a promoterhez önmagában nem elegendő a transzkripció beindulásához. Itt szükséges az is, hogy az „általános transzkripciós faktorok” (general transcription factors) is kapcsolódjanak a gén promoteréhez, ill. az RNS polimeráz II-höz. Az általános transzkripciós faktorok részben segítik az RNS-polimeráz II kötödését a DNS-hez, részben pedig aktiválják azt. A folyamat első lépése a TFIID (transzkripciós faktor II D) kapcsolódása a promoter TATA box régiójához. Ez mintegy 25 bp-ral feljebb van a génen, mint a starthely maga. Amint a TFIID a DNS-hez kötött, az RNS-polimeráz II, valamint a többi általános transzkripciós faktor is képes a promoterre telepedni. Először a TFIIB követi a TFIID-t, és szintén a TATA boxhoz kapcsolódik, majd az RNS-polimeráz II maga kapcsolódik a komplexhez. Az RNS-polimeráz II-höz fog asszociálódni a TFIIE, TFIIF és a TFIIH. Ez utóbbi egy protein kináz, amely több helyen foszforilálja az RNS-polimeráz II-t, ami éppen ezáltal lesz képes beindítani az átírást.

10. ábra A transzkripció folyamata eukariota sejtekben

Egy gén RNS-re átírható részéhez (transcription unit) eukariótákban nem csak egy, hanem nagyon sok általános transzkripciós komplex köthet, szépen sorba rendezve (ezt nevezzük iniciációs frekvenciának). Ennek jelentősége az, hogy egyszerre sok mRNS íródik át, ami nagyon élénk mRNS-szintézist tesz lehetővé.

11. ábra Az iniciációs frekvencia és a DNS DN-áz hiperszenzitív szakaszainak bemutatása vázlatrajzon

Mint korábban láttuk, a DNS heterokromatinizált része, azaz a nucleosomákra tekeredett része inaktív. Ezekhez a részekhez az általános transzkripciós faktorok nem tudnak hozzákapcsolódni. A transzkripciós komplex csak ott tud kialakulni, ahol a DNS nem kapcsolódik a nucleosomákhoz. Azt is láttuk korábban, hogy a nucleosomákhoz nem kötődő DNS sokkal érzékenyebb a DN-áz emésztésre, mint a heterokromatinban ülő részei. Számos kísérlet igazolta azt, hogy az aktív, átírható gének szabályozó régiói éppen ezekben a DN-ázra érzékeny, ún. DH (DN-áz hiperszenzitív) kromatinstruktúrákban ülnek. A DH kromatinstruktúrák többféleképp alakulhatnak ki. Egyrészt igazolták azt, hogy vannak olyan szövetspecifikus, non-histon fehérjék, amelyek szekvenciaspecifikusan kötnek egyes gének szabályozó régióihoz, és nem engedik a nucleosomális szerkezet felépülését, azaz gátolják a DNS hisztonfehérjékhez való kapcsolódását. Más esetekben azt tapasztalták, hogy a transzkripciós faktorok között vannak olyan specifikus működésű fehérjék, amelyek az általános transzkripciós komplexhez kötve destabilizálják a nucleosomákat és leválasztják őket a DNS-ről. Tehát a DNS dekondenzációját ebben az esetben maga a transzkripciós komplex okozza. A nucleosomák leválasztásának a leggyakoribb változata az, amikor a génműködést szabályozó (serkentő) fehérjék egyikéhez ún. hiszton-acetil-transzferázok kötődnek. Ez utóbbi enzimek acetilálják a nucleosomákban ülő hisztonokat és ezzel elősegítik azok leválását a DNS adott szakaszáról. A nucleosomális szerkezet ezen átalakulását nevezzük kromatin remodellingnek.

Más kísérleti eredmények a fentiekkel szemben azt igazolták, hogy a kromatinszerkezetet nem egyszerű átrendezni, sőt a heterokromatin állomány a vele szomszédos gének átírását, aktivitását nagyon erősen befolyásolja. Élesztőben a fehér színt meghatározo gént áthelyezték a heterokromatint tartalmazó telomérák közelébe és azt tapasztalták, hogy minél közelebb kerül a telomérához a fehér színt meghatározó gén, annál inkább gátlódik a működése; az élesztő annál pirosabb lesz. Hasonló eredményekre jutottak Drosophila esetében is. Az erősen heterokromatinizált régiók itt is gátolják a környezetükben levő gének aktivitását és ez a gátlás a fizikai közelséggel arányosan erősödik. A jelenséget „position effect”-nek nevezzük.

1979-ben fedezték fel, hogy az eukariota gének átíródásához nem elegendő az, hogy a generalis transzkripciós komplex hiba nélkül kapcsolódik a gén promoter régiójához. Az átíráshoz, a gén aktivációjához az is szükséges, hogy a gén előtt vagy mögött elhelyezkedő serkentő, erősítő, ún. „enhancer” régiókhoz a megfelelő szabályozó fehérjék kötődjenek és ezek az enhancer régiók közvetlen kapcsolatba kerüljenek az adott gén promoter régiójával. Az enhancer régiók és a promoter között „spacer” szekvenciaelemek vannak.

12. ábra A génműködést szabályozó régiók és az azokhoz kapcsolódó szabályozó fehérjék, valamint az általános transzkripciós faktorok elhelyezkedése a genomban

Az enhancer (regulációs) DNS-szakaszokhoz szabályozó fehérjék kötődnek. Ezek lehetnek serkentők és gátlók egyaránt. Az, hogy egy szabályozó szekvencia éppen serkenti vagy gátolja az adott gén átíródását, az attól függ, hogy hozzá aktuálisan milyen természetű szabályozó fehérjék kötődnek. A génműködést szabályozó fehérjék kis mennyiségben termelődnek és szekvenciaspecifikusan kötődnek a szabályozó régiókhoz. Sokan úgy gondolják, hogy a szabályozó regió(k) fizikailag is kapcsolatba lépnek a promoter régióval úgy, hogy a DNS egy vagy több hurkot vet.

13. ábra Egy rajz a génműködést szabályozó régióknak a promoterhez való fizikai kapcsolódásáról

A fentiek értelmében arra a következtetésre jutottak a kutatók, hogy egy gén kifejeződése (expressziója) elsősorban attól függ, hogy a szabályozó régióihoz milyen szabályozó fehérjék kötődnek. A szabályozó fehérjék a sejtmag alapállományában egymással komplexeket alkotnak és ezek hatása attól függ, hogy aktuálisan milyen szabályozó fehérjék vannak bennük. Azt, hogy egy komplex serkenti vagy gátolja a gén kifejeződését, a szabályozó fehérjék kombinációja határozza meg. Nem lehet tehát kijelenteni, hogy melyik szabályozó fehérje serkentő, melyik gátló hatású, mivel ezt az határozza meg hogy milyen más szabályozó fehérjékkel alkot komplexet. A rendszer működését az even skipped (eve) gén példáján mutatjuk be. Az eve a Drosophila szelvényezettségét meghatározó pair rule gének közé tartozik és minden második parasegmentumban fejeződik ki, azaz hét expressziós sávja van a fejlődő embrióban (a syncytialis blastoderma stádiumban). Az eve génnek igen nagy, kb. 20.000 bp hosszúságú regulációs része van. Ebben hét modult azonosítottak - amelyek szerkezete nagyjából hasonlít egymáshoz - a hét expressziós csíknak (embrionális szelvénynek, parasegmentumnak) megfelelően. Közülük a 2. szelvény regulációs modulját izolálták és mögé egy riporter gént kapcsoltak. Ezt a konstrukciót viszajuttatva az állatokba azt tapasztalták, hogy a riporter gén (Gal4) csak a 2. szelvényben expresszálódott, a regulációs szakasznak megfelelően.

14. ábra Az eve gén 2. szabályozó moduljának ellenőrzése alatt kifejeződő riporter gén expressziós mintázata a fejlődő embrióban

Ennek a szabályozó modulnak a további, részletes analízise bizonyította, hogy benne öt olyan szakasz van, amely a bicoid szabályozó fehérjét (morfogént), egy, amelyik a hunchback fehérjét, három, amelyik a Krüppel nevű szabályozó fehérjét és három, amelyik a giant morfogént köti. Azt is bizonyították, hogy a bicoid és a hunchback serkenti, a Krüppel és a giant gátolja az eve kifejeződését. E négy morfogén koncentrációja határozza meg, hogy az eve mikor és hol jelenjen meg a fejlődés során.

15. ábra A eve gén 2. szabályozó moduljához kapcsolódó szabályozó fehérjék (morfogének) száma és megoszlása

Azt is megállapították, hogy a gén kifejeződéséhez szükséges mindkét serkentő morfogén jelenléte, de már az egyik gátló hatású szabályozó fehérje elegendő a gén kifejeződésének gátlásához. Mint az ábrán látszik, a négy pozicionális morfogén (génműködést szabályozó fehérje) csak és kizárólag a 2. embrionális testszelvényben van jelen ebben a kombinációban, tehát az adott szabályozó régió kontrolja alatt csakis itt fejeződhet ki.

16. ábra Az eve kifejeződését szabályozó morfogének koncentrációja a lárvális szelvényekben

A DNS-ről átíródott primer mRNS mindkét vége módosul. Ha ezek bármelyike nem zajlik le vagy hibás, akkor a keletkezett transzkript lebomlik még a sejtmagban. Valamennyi mRNS 5’ végén egy „cap” (sapka) keletkezik. Először egy Gp rakódik fel GTP-ből az 5’ végre, majd a bázis maga és a ribóz is foszforilálódik egy-egy helyen. Ez a „capping” védi meg az mRNS-t a degradációtól. (Ha in vitro csinálunk RNS-szintézist, a capping nélkül e rendszerben is elveszítjük az összes átírt RNS-ünket.)

17. ábra A capping folyamatrajza

A primer mRNS 3’ végén egy AAUAAA szekvencia van, kb. 10-30 bp távolságra upstream a hasítási (leválási) helytől. Mikor a frissen szintetizálódott RNS-molekula leválik a DNS-polimeráz komplexről, egy enzim 100-200 A-t épít fel a 3’ végére. Ezt nevezzük polyA-tail-nek (poliA-farok). A polyA-tail nélküli mRNS-molekulák nem jutnak ki a sejtmagból a citoplazmába, ha véletlenül mégis kijutnak, akkor a citoplazmában azonnal elbomlanak, ha pedig nem bomlanak el, akkor sem tudnak riboszómákhoz kapcsolódni, tehát biológiai funkciójuknak nem tudnak eleget tenni.

Az 1970-es években már több gént (ovalbumin, β-globin) és a róluk másolódó mRNS-t is ismertek, és mindenkinek feltűnt, hogy a gén és a róla átíródó primer transzkript jóval nagyobb (átlag 7000 bp hosszúságú), mint az érett, funkcióképes mRNS (ami durván 1500 bp hosszú). Az is kiderült, hogy az mRNS mindkét vége ép marad, tehát valahonnan a molekula közepéből tűnik vagy tűnnek el részek az érés (processing) során. Erre utalt az a megfigyelés is, hogy a pulzusszerű uridin jelölésnek csupán 5%-a mutatható ki a citoplazmában, azaz jelentős része eltűnik még a sejtmagban. Amint a DNS és RNS szekvenciák összehasonlítása lehetővé vált, kiderült, hogy szinte minden primer mRNS-ből kivágódnak egyes szakaszok és nem jelennek meg az érett mRNS-ekben. A kivágódó, hiányzó részeket intronoknak, a kivágódás (splicing) után megmaradókat exonoknak nevezték el.

18. ábra Az intronok és az exonok elhelyezkedését szemléltető ábra az ovalbimin gén példáján

Az eukarióta sejtekben az elkészült primer mRNS gyakorlatilag azonnal fehérjékhez kapcsolódik, rájuk csavarodik. E fehérjék hatalmas komplexeket alkotnak, amelyek átmérője 20 nm körül van, tehát kitűnően megfigyelhetők az elektronmikroszkópos preparátumokon. Ezen komplexek több helyen és nagy valószínűséggel szekvenciaspecifikusan kötnek az RNS-molekulákhoz. Ezzel egyrészt megvédik az mRNS-eket a lebomlástól, másrészt ezen fehérjekomplexek egyes tagjai bizonyosan részt vesznek az intronok kivágódásában. Ezért e fehérjék együttesét spliceosomának nevezzük. A komplexben vannak olyan fehérjék, amelyek az intronok 5’ határán levő Gn szekvenciákat, mások pedig a 3’ végen levő AG szekvenciákat ismerik fel. A komplex más tagjai e két fehérjét egymás mellé húzzák. Ezzel fizikai kapcsolatba kerül az intron két vége is, aminek következtében az intron egy hurokszerű struktúrát fog alkotni. Ugyancsak a fehérjekomplexhez tartoznak azok az enzimek, amelyek elvágják az RNS-t az exon-intron határokon. Végül a komplex következő tagja összeforrasztja (ligálja) a két exon 5’-3’ végeit. A hurokba rendeződött intronok pedig leesnek a spliceosomákról és lebomlanak a sejtmagban.

19. ábra A splicing és a spliceosomát alkotó egyes fehérjék működése a splicing során

Ha a spliceosomáknak bármelyik tagja, alegysége pl. mutáció következtében nem működik helyesen és az intronok nem vágódnak ki a mRNS-ekből, akkor azok benn maradnak a sejtmagban és soha nem tudnak kijutni a citoplazmába, azaz nem tudják funkciójukat ellátni.

Megjegyzendő az is, hogy a splicing folyamata gyakorta úgy módosul, hogy az érett mRNS-be nem kerül be az összes exon, hanem egyesek hiányoznak belőle. Ez az ún. alternatív splicing jelensége. Következménye az, hogy az ilyen mRNS-ekről más funkciókkal rendelkező fehérjék másolódnak. Azaz egy gén több, sokszor merőben különböző sejtműködésekhez szükséges fehérjét hozhat létre az alternatív splicing segítségével.

Amennyiben a capping, a polyA-farok felépítése és a splicing hibátlanul lezajlott a sejtmagban, a létrejövő mRNS képes kijutni a sejtmagból a citoplazmába. Nyilvánvaló, hogy ez a magpórusokon keresztül történik.

Egy sejtmag maghártyáján átlagosan 1000-3000 pórust lehet látni az ultrastruktúrális képen. A magpórus nem egy egyszerű nyílás, lyuk a maghártyán, hanem összetett struktúra. A felépítésében és a rajta keresztül zajló transzportfolyamatok szabályozásában mintegy 100-féle fehérje vesz részt. A magpórusnak van egy központi, hidrofil csatornája, amelyen keresztül a pórus átmérőjénél kisebb, vízoldékony molekulák szabad diffúzióval cserélődhetnek a sejtmag és a citoplazma terei között. Az 5 kiloDaltonnál (kD) kisebb molekuák számára a magpórus nem jelent akadályt. A 17 kD méretűek 2 perc alatt cserélődnek ki, míg a 40 kD nagyságúak 30 perc alatt. A 60 kD-nál nagyobbak számára a pórus már átjárhatatlan. A nagyméretű molekulák csak a pórusfehérjékhez kötve, azok segítségével juthatnak át a póruson. Mindezen adatok alapján a magpórus átmérője 9 nm-nek adódik, tehát sokkal kisebbnek, mint amekkorának az elektronmikroszkópban látjuk.

A magpórus fehérjéi számos csoportba sorolhatók: 1. oszlopos fehérjék, amelyek a pórus falát alkotják 2. lumináris fehérjék, amelyek a pórus ürege felé nyomulnak be 3. kapcsoló fehérjék, amelyek az előbbieket a maghártyához rögzítik 4. gyűrűfehérjék, amelyek a citoplazma és a sejtmag belseje felé is egy-egy gyűrűt képeznek 5. fibrilláris fehérjék, amelyek hosszú fonalakat alkotnak mind a sejtmag tere, mind a citoplazma felé. (A citoplazmatikusak kosárszerűen összefonódnak.)

20. ábra A magpórusokat alkotó fő fehérjetípusok elhelyezkedése a pórusban (A) és a pórusfehérjék alkotta szerkezet vázlata (B)

Az érett mRNS-ek a magpórusokon keresztül nagy valószínűséggel fehérjék segítségével jutnak át. A spliceosomáktól transzportfehérjék veszik át őket, majd a citoplazmában más fehérjékhez kötődve jutnak ki. Ott ismét más fehérjék játszanak szerepet a riboszómákhoz való jutásukban. A mai felfogás szerint tehát az mRNS-molekulák a keletkezésüktől a felhasználásukig végig fehérjékhez kötve vannak a sejtben.

21. ábra Az mRNS kijutása a sejtmagból a magpóruson keresztül

A citoplazmába kijutó mRNS-ek a riboszómákhoz szállítódnak és azokhoz kötődnek a polyA-farok segítségével. Életidejük a citoplazmában változó. Vannak egészen rövid életidejűek, amelyek csak percekig maradnak működésképesek (pl. hisztonok mRNS-ei). Mások 30-60 percig működnek (pl. növekedési faktorok, szabályozó fehérjék mRNS-ei). A harmadik csoportba tartoznak a struktúrfehérjék és az enzimek mRNS-ei. Ezek 10-12 óráig életképesek. Az életidő meghatározásában a poly-A faroknak van döntő szerepe. A citoplazmában a polyA-farok folyamatosan bomlik, rövidül. Ha 10-30 A-nál rövidebb lesz, akkor az egész mRNS lebomlik. Azokra az mRNS-ekre, amelyekre hosszabb ideig van szükség, a sejt újabb és újabb A-kat kapcsol, így folyamatosan hosszan tartja a polyA-farkat. Petesejtekben ez a mechanizmus nem működik. A petesejtekből hiányzik a polyA-farkat lebontó apparátus, ezért az anyai eredetű mRNS-ek nagyon hosszú ideig (napokig, hetekig) is életképesek maradnak. Amikor a fejlődés során az egyes meghatározott anyai eredetű mRNS-ekre szükség van, akkor a petesejt azokra hosszú poly-A farkat szintetizál.

Egyes mRNS-ek (főként fejlődésszabályozó fehérjék mRNS-ei) határozott lokalizációt mutatnak a sejten belül. Ezeken olyan nem transzlálódó szekvenciák vannak, amelyek a molekulát a sejtvázhoz kötik és így biztosítják jellegzetes lokalizációjukat a sejtben (pl. bicoid).