Bár a legtöbb - nem túl nagyméretű - fehérje magától is képes kialakítani helyes szerkezetét, ez sokkal gyorsabban végbemegy, ha dajkafehérjék is segítenek. A korábban is említett, ER-ben lokalizálódó BiP chaperon már a transzlokáció során, a luminális oldalon kapcsolódik a befelé haladó fehérjelánchoz. Azáltal, hogy felismeri és átmenetileg köti az egyes kisebb hidrofób szakaszokat, megakadályozza, hogy azok egymással számukra pillanatnyilag energetikai szempontból kedvezőbb, de aspecifikus kölcsönhatásba lépjenek, esetleg aggregálódjanak. Miután ezek a szakaszok normálisan a kész fehérje (vagy fehérjekomplex) belsejében vannak, a BiP chaperonok mindaddig újra és újra visszakötődnek, míg a helyes struktúra ki nem alakult – ily módon hozzá is járulnak az „éretlen” fehérjék ER-ben tartásához. A fentiekből következik, hogy nemcsak az egyedi fehérjék, hanem a monomerekből felépülő bonyolultabb komplexek is kialakulnak az ER-ben, és ezek is csak hibátlan negyedleges szerkezettel hagyhatják el azt. A BiP-ek működéséhez, ahogy erről már korábban, a poszttranszlációs transzlokáció tárgyalásánál is szó esett, ATP-hidrolízisre van szükség (10. ábra).
10. ábra A Hsp70 chaperon-fehérjék családjába tartozó BiP szerepe az ER-be érkező fehérjék helyes térszerkezetének kialakításában. A BiP ATP-kötött állapotban – de csak ekkor - kis affinitással képes a fehérjék felszíni hidrofób részeihez kapcsolódni. A megkötött ATP hidrolízise után (melyet az ábrán nem szereplő “segéd” chaperonok aktiválnak), ADP jelenlétében azonban tartósabb kölcsönhatás jön létre köztük. Nukleotid-cserélő faktorok (NEF, nucleotide exchange factor) hatására a BiP-ről ledisszociálódó ADP helyére ismét ATP köt be, a “dajkált” fehérje megint könnyen leválhat, a BiP újabb ciklusba léphet. Az ismétlődő kötődés-szétválás ciklusok során a formálódó fehérjének jut ideje a megfelelő szerkezet felvételére, anélkül, hogy nagy eséllyel aggregálódhatna más érésben lévő, felszíni hidrofób elemeket tartalmazó fehérjével.
A fehérjék „feltekeredését” gyakran lassítja, hogy a prolin részvételével kialakult peptidkötések mentén a - más aminosavak között egyébként energetikailag favorizált - transz helyett nagy valószínűséggel cisz helyzet is kialakulhat. Miután a kész fehérjében ezeknek a prolin melletti kötéseknek az egyik meghatározott formában stabilizálódniuk kell, az izomerizáció katalizátorai, a peptidil-prolil izomerázok meg tudják gyorsítani a folyamatot, különösen prolinban gazdag fehérjék esetében.
Mindeközben más enzimek is elvégzik azokat a módosításokat, amelyek szintén elengedhetetlenek a megfelelő konformáció létrejöttéhez.
A legáltalánosabb, az ER-be érkezett legtöbb fehérjén bekövetkező módosulás az N-glikoziláció. Ennek során egyes aszparaginok oldalláncának NH2-csoportjához egy oligoszacharid „fácska” kapcsolódik, amelynek valamennyi eukariótában ugyanolyan a szerkezete: 14 cukormolekula (N-acetilglükózamin, mannóz és glükóz) kapcsolódik össze elágazó „fácskát” alkotva (11. ábra).
11. ábra Az N-glikoziláció során az ER lumenébe szintetizálódó fehérjelánc egyes aszparaginjaira egy egységes szerkezetű, 14 cukormolekulából álló elágazó oligoszacharid lánc kerül. A cukorlánc soklépéses folyamat során épül fel a dolikol nevű lipiden, ahonnan az oligoszacharid-transzferáz enzim pirofoszfát-kötés bontásából felszabaduló energia felhasználásával kapcsolja a fehérjeláncra.
Bár az N-glikoziláció lehetséges pozíciója leírható az Asn-X-Ser/Thr képlettel (ahol X bármilyen aminosav lehet), azt, hogy az ilyen helyek közül melyikre kerül fel valóban a cukoroldallánc, szekvencia alapján nem lehet megjósolni, valószínűleg térszerkezeti szempontok is meghatározzák. Az adott helyen bekövetkezett N-glikozilálódás a legtöbb fehérje végleges konformációjának kialakításában mindenképpen szerepet kap, de bizonyos esetekben elengedhetetlen is a helyes térszerkezet létrejöttéhez. Az elkészült és szekretált fehérjék stabilitását is megnövelheti, és további módosulások révén a sejtfelszíni fehérjék és az általuk létesített kapcsolatok specificitására döntő mértékben hathat. (Megjegyezzük, hogy az úgynevezett O-glikoziláció, mely során szerin vagy treonin OH-csoportjára kerül egy jóval rövidebb és egyszerűbb szerkezetű cukoroldallánc, a Golgi készülékben vagy a citoplazmában következhet be.)
A folyamatot katalizáló oligoszacharid-transzferáz az ER-membránjába integrálódott enzimkomplex, mintegy „lesben áll” a transzlokon mellett: a citoszol felé eső részén két alegysége is a riboszómával lép kölcsönhatásba, így rögzíti az enzimet a csatorna közelében. Ily módon rögtön „leolvashatja” az ER-be frissen érkező peptidláncot, és a megfelelő jelet érzékelve rápakolja a már előre elkészült teljes oligoszacharid „fácskát”, egy dolikol nevű poliprenol lipidről. A transzfer energiaigényét a cukorlánc és a dolikol közötti pirofoszfát-kötés felszakadása biztosítja (11. ábra). A teljes 14-tagú cukorlánc tehát már előzőleg, a dolikolhoz kapcsolódva jön létre, a kezdeti lépések a citoszol felőli oldalon mennek végbe, a befejezés az ER-ben zajlik. A soklépéses folyamatról biokémiai könyvekből tájékozódhatunk.
Az eredeti cukorlánc glikozidázok révén már az ER-ben rögtön rövidülni kezd, aminek nagy szerepe lesz a minőségellenőrzésben (lásd később). Az ER-ből kilépő fehérjék még egységes szerkezetű, két N-acetil-glükózaminból és nyolc mannózból álló „fácskát” tartalmaznak. A glikoproteinek cukoroldalláncainak szabás-varrása (processzálása) aztán a Golgi-készülékben teljesedik ki igazán, de a „törzset” alkotó öt cukor (két N-acetil-glükózamin és három mannóz) valamennyi végleges oldalláncban megmarad.
A szekretált fehérjékben és a membránfehérjék extracelluláris részében gyakran találhatunk diszulfid-kötést. A citoplazma redukáló közege inkább a tiol-forma fennmaradásának kedvez, ezért az ezen fehérjék térszerkezetét alapvetően meghatározó intra- vagy intermolekuláris diszulfid-hidak csak az ER lumenében jöhetnek létre. Ott is jelen kell lennie egy oxidáló faktornak, mert két –SH csoport között magától még oxidatív körülmények között is csak igen lassan jön létre kötés. Ezt a feladatot látja el a protein diszulfid izomeráz (PDI), amely valamennyi eukarióta sejtben megtalálható. Az enzim katalitikus helyén tioredoxin doméneket tartalmaz, amelyek diszulfid-kötést tartalmaznak. Az enzim ezek révén először a képződő fehérjelánc egyik ciszteinjének tiolcsoportjával kapcsolódik kovalensen, majd egy másik közeli tiolcsoport hatására a PDI redukálódik, maga után hagyva egy, a szubsztráton kialakult diszulfid-hidat. A PDI újraoxidálásáról más ER-ben található enzim gondoskodik (12. ábra).
12. ábra Az ER lumenében található PDI (protein diszulfid izomeráz) sokszor több ciklusban, saját diszulfid-hídjainak redukciója révén alakítja ki az ER-be jutó fehérjeláncon a tiol-csoportok között a diszulfid-kötéseket. A PDI „visszaoxidálásáról” az EroI enzim gondoskodik. A hibás térszerkezetű fehérjék rossz helyen létesült diszulfid-hídjait is a PDI alakítja át, egy másik fontos ER-chaperonnal, a kalretikulinnal együttműködésben.
Mi a helyzet azokkal a fehérjékkel, amelyekben nemcsak két cisztein van, tehát diszulfid-híd többféle kombinációban is kialakulhat? Logikus, hogy az ER-be fokozatosan nyomuló peptidláncon először a már szintetizálódott, egymás közelében elhelyezkedő ciszteinek között jön létre ez a kapcsolat – azonban egyáltalán nem biztos, hogy a végső szerkezetben is itt kell lennie. A helyes párok formálódását is a PDI biztosítja, úgy, hogy redukált formájában a már létesült, de instabil, reaktívabb diszulfidhidakat szétbontja, majd újabb, kevésbé reaktív kombinációkat hoz létre, mindaddig, míg a fehérje fel nem veszi legstabilabb szerkezetét. Ez gyakran más, a fehérjék helyes konformációjának kialakításában szerepet játszó fehérjékkel, például a kalretikulinnal (lásd később) karöltve teszi (12. ábra).
A membrán integráns fehérjéi sokszor nem képesek a lipidmembránban laterálisan elmozdulni, mert citoplazma felőli részüket „fogva tartja”, immobilizálja például a citoszkeleton valamelyik komponense. A sejthártya extracelluláris oldalán egyes fehérjék szabadabb mozgását teszi lehetővé az, hogy nem hidrofób α–hélix révén, hanem egy amfipatikus glikolipid, a glikozil-foszfatidil-inozitol (GPI) által horgonyzódnak a membránba. A GPI-horgony a fehérje útjának végállomását is meghatározhatja: lipid-tutajokba, illetve egyes polarizált sejtekben az apikális felszínre irányítja őket.
Ezen fehérjék szintézise követi az I. típusú transzmembrán fehérjék képződésének lépéseit: N-terminális szignáljuk levágódik, majd belső hidrofób doménjük révén megrekednek az ER membránjában. Egy transzamidáz nevű enzim azonban, miután a transzmembrán domén lumen felőli végénél felismeri a megfelelő szekvenciát, levágja a a membránt átívelő szakaszt és a „maradék” fehérjelánc újonnan kialakult C-terminálisát összekapcsolja egy, a membránban várakozó GPI terminális (etanolaminon található) aminocsoportjával (13. ábra).
13. ábra A GPI (glikozil-foszfatidil-inozitol)-horgonyos fehérjék kialakulása. A fehérjék az I. típusú transzmembrán fehérjékhez hasonlóan először hidrofób α–helikális doménjükkel a membránba ékelődnek. A megfelelő szignál felismerése után egy transzamidáz nevű enzim a fehérjét elhasítja membrándoménjének lumen felőli végénél, majd rákapcsolja egy GPI terminális etanolaminjának aminocsoportjára. További módosítások után, amelyet PGAP-ok (post-GPI-attachment to proteins) hajtanak végre, a kész GPI-horgonyos fehérje továbbhaladhat a szekréciós úton, a plazmamembrán irányába.