Drosophilában leírtak 2 olyan mutánst, amelyek genotípusosan mitokondriális fehérjéket kódoló génekben defektívek, fenotípusosan pedig megrekednek a sejtosztódás G1/S pontjában. Ez azért különösen nagy jelentőségű, mert ez az első olyan eset, amikor egy celluláris folyamatot (sejtosztódás) egy sejtorganellum (mitokondrium) szabályoz. A két mutáns (Pdsw és CoVa) két jelentősen eltérő fenotípust mutatott. A Pdsv a normálisnál intenzívebb ROS-termeléssel, míg a CoVa mutáns a normálisnál alacsonyabb ATP-szinttel különbözött a vadtípustól. Kiderült, hogy a reciprok viszonyokban mindkét mutáns teljesen normális, azaz a Pdsw normális ATP-szinttel, a CoVa pedig normális ROS-szinttel rendelkezett. Kézenfekvőnek látszott tehát az a feltételezés, hogy a két mitokondrium-eredetű mutáció más-más szignalizációs utakon jut el a sejtmagba és blokkolja a sejtosztódást.

Ezen potenciális különbségek felderítése céljából megvizsgálták mindkét mutánsban a ciklin E-szintet, amely ciklin specifikusan a G1/S átmeneti szakaszban éri el maximális mennyiségét normál körülmények között. Kiderült, hogy a CoVa a normálisnál jóval alacsonyabb ciklin E-szinttel rendelkezik, de a Pdws mutánsban a ciklin E-szint normális. Ez teljesen érthető és elfogadható a CoVa esetén, de nagyon meglepő a Pdsw esetén, tekintve, hogy az alacsony ciklin E-szint („down-regulation”) magyarázná meg igazán a G1/S blokkot. Tehát, valami más mechanizmus kell, hogy működjön a Pdsw mutánsban, ami annak ellenére megakadályozza a ciklin E funkcióját, hogy az fizikailag jelen van. Az egyik ilyen lehetőség az, hogy túltermelődik egy olyan gátló fehérje (p27), amely specifikusan gátolja a ciklin E-CDK2 komplex kialakulását. A p27 fehérje egy ciklinE-CDK2 inhibítor, amely szerepet játszik a sejtosztódás szabályozásában és a sejtosztódást szabályozó hatóanyagok hatásmechanizmusában. Az egyik ilyen faktor, pl., a TGFβ, epiteliális sejtekben leállítja az osztódást a p27 aktiválásán keresztül. Nem meglepő az sem, hogy a p27 mutált változatát mutatták ki emlős tumorokból. Kiderült, hogy a CoVa mutánsban a p27 expressziója normális szinten ment végbe, de a Pdsw mutánsban a gén expressziójának fokozódása („up-regulation”) történt meg.

Az eddigi kísérletek tehát azzal az eredménnyel zárultak, hogy a CoVa mutánsban a ciklin E downreguációja, a Pdsw-ben pedig a p27 upregulációja felelős a G1/S blokk kialakulásáért. A következő kérdés az volt, hogy a Pdsw mutánsban megfigyelt szupraoptimális ROS szint tölthet-e be szignál-szerepet. Ennek vizsgálatára túltermeltették a katalázt kódoló gént mindkét mutáns vonalban. A kataláz a legfontosabb H2O2-t bontó enzim a sejtekben, amely által katalizált reakció: 2 H2O2 → 2 H2O + O2. Látható, hogy az enzim igen hatékonyan működik, hiszen egyetlen „ciklusban” 2 molekula H2O2 eliminációját valósítja meg. Emellett a kataláz rendelkezik az egyik legmagasabb átviteli számmal (turnover number), ami az aktív centrumra időegységenként eső átalakított molekulák számát jelenti. A gyakorlatban tehát egy molekula kataláz több millió H2O2 eltüntetését végzi másodpercenként. A Pdsw mutánsban a kataláz overexpresszió a G1/S gátlás feloldását, azaz az S fázisba történő belépést eredményezte, míg a CoVa mutánsban a sejtek a G1 fázisban maradtak. Ez igen fontos bizonyíték volt arra, hogy a szabad gyökök (amelyekből származó hidrogén-peroxid eliminációját végzi a kataláz) a Pdsw mutánsban fontos szerepet játszanak a mitokondrium-sejtmag szignalizációban.

Mivel a G1/S ellenőrzési pont egyik fontos regulátora a p53 fehérje, ezután azt vizsgálták, hogy a p53 downregulációja hogyan változtatja meg a két mutáns viselkedését. Kiderült, hogy ez a beavatkozás a CoVa mutánsot lendíti át a G1/S ponton, míg hatástalan a Pdsw mutánsban. Ez a CoVa mutáció molekuláris felderítése szempontjából jó hír volt, de meg kellett találni azt a komponenst, ami a Pdsw mutánsban kiváltja a G1/S blokkot. Végigvizsgálták az összes olyan lehetőséget, amely elképzelhető egy ilyen szignalizációs útvonal részeként, és végül a JNK (c-Jun N-terminális kináz) downregulációjával sikerült elérni, hogy a Pdsw mutáns belépett az S fázisba, azaz a JNK ebben a mutánsban a mitokondrium-sejtmag szignalizációs útvonal egyik fontos komponense. A CoVa mutánsban ez a beavatkozás hatástalan maradt, tehát az a szignalizációs út nem a JNK-n keresztül halad. A JNK (c-Jun N-terminális kináz) a mitogén-aktivált protein kinázok egyik tagja, amely kötődik a c-Jun proto-onkogénhez, és foszforilálja a Ser63 és Ser73 pozíciókat annak transzkripcionális aktiváló doménjében. Kimutatták, hogy a JNK gyakran aktiválódik stresszhatásokra (pl. ROS). Végül kiderült, hogy a JNK target-fehérjéje a FoxO transzkripciós faktor (9. ábra).

9. ábra

A Fox fehérjék az először Drosophilában leírt transzkripciós faktor-család tagjai, amelyek közös jellemzője egy 80-100 aminosavból álló speciális struktúra, az ún. forkhead-box, amely a fehérje DNS-hez történő kötődését valósítja meg. Transzkripciós faktorok széles skálája tartozik a Fox fehérjék közé, amelyeket alcsoportokba sorolnak. A FoxO fehérje tehát a Forkhead box fehérjék O alcsoprtjába tartozik. A P alcsoportba tartozó egyik korábban világhírűvé vált Forkhead box fehérje a FoxP2. Összehasonlító humángenetikai vizsgálatok arra a következtetésre jutottak, hogy a FoxP2 fehérje megjelenése mintegy 200000 évvel ezelőtt az emberré válás során a nyelv kialakulásának egyik molekuláris determinánsa volt. Ma élő emberekben, pedig ennek a fehérjének mutáns változatát mutatták ki olyan betegekből, akiknek nyelvtanulási, grammatikai és hangképzési nehézségeik voltak.

Mindezen kísérletei eredmények birtokában tehát felvázolható a két mutáció szignalizációs útvonala a mitokondriumból a sejtmagba Drosophilában. A Pdsw mutánsban a mitokondriális defektus szupraoptimális ROS termelésben mutatkozik meg, ami egy szignál molekula és aktiválja c-jun N-terminális kinázt (JNK), amely a FoxO transzkripciós faktoron keresztül aktiválja (upregulálja) a p27 fehérjét (egy ciklin E- CDK2 inhibítort), amelynek szupraoptimális jelenlétében a funkcionális ciklinE-CDK kapcsolódás elmarad, tehát a sejtciklus a G1 fázisban megreked. A CoVa mutánsban a mitokondriális defektus szuboptimális ATP- és szupraoptimális AMP-szintekben mutatkozik meg. A megnövekedett AMP az a szignál-molekula, amelynek szupraoptimális szintje az AMP-függő protein kináz(ok) (AMPK) aktiválásához vezet. Az AMPK target-fehérjéje a p53, amely a ciklin-E csökkenéséhez vezet, tehát a sejt ugyanúgy megreked a G1 fázisban, mint a Pdsw mutáció eredményeként (10. ábra).

10. ábra

E kísérletek igen fontos eredménye, hogy a mitokondrium-sejtmag retrográd szignalizációban mind a ROS, mind az AMP szignál-molekulák. A ROS szignál üzenete ez lehet: „nagy mennyiségben jelen vagyok, tehát már sok fehérje károsodását okoztam”. Az AMP-szignál üzenete ez lehet: „nagy mennyiségben jelen vagyok, tehát gond van az ATP-utánpótlással”. Feltehetően egy sérült mitokondriumban mindkét útvonal aktiválódik és vagy így, vagy úgy, de a sejtosztódás leállításához vezet. Ez igen fontos celluláris döntés, és a sejtnek lehetőséget ad egyrészt a ROS által károsított fehérjék kijavítására, másrészt a roppant ATP-igényes S és M fázisok mindaddig nem fognak elindulni, amíg az ATP-szintézisben bekövetkezett zavar helyre nem áll.